Rezultate etapa I/2012

Pe măsura descoperirii efectelor probiotice ale bacteriilor lactice, înţelegerea profundă a mecanismelor care stau la baza acestor efecte benefice a devenit o necesitate în special datorită faptului că aceste efecte sunt tulpină specifice. Pentru atingerea obiectivelor propuse în cadrul proiectului, în prima etapă a fost obţinuta o minicolecţie de 224 tulpini nou izolate de bacterii lactice din nișe ecologice specifice, caracterizarea acestora şi încadrarea taxonomică preliminară.

Sursele de izolare au fost foarte variate şi au acoperit un larg spectru ecologic, fiind reprezentate de: fecale de nou-născut, lapte, produse alimentare fermentate şi vegetale fermentate. Pentru caracterizarea şi încadrarea taxonomică preliminară tulpinile izolate şi purificate au fost analizate din punct de vedere morfologic (aspect microscopic şi macroscopic), fiziologic (creşterea la diferite valori de temperatură și halotoleranța) şi biochimic (producerea de catalază, producerea de acizi organici, capacitatea de metabolizare a diferitelor surse de carbon). Ulterior, pentru confirmarea statutului taxonomic, aceste tulpini au fost analizate cu ajutorul kiturilor standardizate API şi a sistemului BIOLOG.

S-a semnalat prezenţa unor variaţii în ceea ce priveşte particularităţile morfofiziologice şi biochimice ale tulpinilor izolate în funcţie de provenienţă. Din punct de vedere al morfologiei celulare, tulpinile izolate din produsele fermentate se prezintă în general sub formă de coci, iar cele din fecale prezintă preponderent bacilare sau cocobacilare. În ceea ce privește caracteristicile fiziologice şi biochimice tulpinile izolate din tract digestiv uman au capacitate mai scăzută de biosinteză a acizilor organici şi rezistenţă mai scăzută la variaţii de temperatură comparativ cu cele din produsele fermentate.

În urma tuturor determinărilor microbiologice şi biochimice efectuate, tulpinile de bacterii lactice izolate au fost identificate ca aparţinând genurilor: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, Streptococcus şi Pediococcus. În vederea continuării la nivel molecular a studiului privind efectul probiotic, tulpinile au fost crioconservate şi păstrate în colecţia Departamentului de Genetică a Facultăţii de Biologie.

 

Rezultate etapa II/2013

 

Principalul obiectiv al prezentei etape a constat în selectarea tulpinilor cu potenţial probiotic din minicolecţia de bacterii lactice izolate în etapa anterioară (224 tulpini), atât prin metode convenţionale, cât şi prin metodologii moderne. Cercetările au vizat: determinarea in vitro a siguranţei utilizării tulpinilor selectate ca probiotice pentru sănătatea umană; evaluarea calitativă şi cantitativă a activităţii antimicrobiene faţă de microorganisme enteropatogene; analiza interacţiunilor dintre tulpinile de bacterii lactice şi celule eucariote epiteliale; caracterizarea compuşilor biologic activi produşi şi testarea in vitro a rezistenţei tulpinilor de bacterii lactice în condiţii similare celor de la nivelul tractului gastrointestinal.

Un aspect deosebit de important analizat în această etapă a fost stabilirea măsurii în care tulpinile de bacterii lactice selectate nu afectează sănătatea umană şi corespund criteriilor ghidului FAO/WHO. Astfel, aproximativ 30% dintre tulpinile de bacterii lactice luate în studiu au prezentat activitate hemolitică redusă după 48h, ceea ce a condus la excluderea acestora din studiu. Datorită posibilităţii apariţiei fenomenelor de transfer al genelor de rezistenţă la antibiotice la alte tulpini patogene a fost analizat spectrul de sensibilitate la antibiotice. S-a constatat că majoritatea tulpinilor analizate prezintă sensibilitate la cloramfenicol şi rezistenţa la kanamicină. În plus, 50% dintre tulpini nu prezintă rezistenţă la antibiotice precum ampicilină, tetraciclină, eritromicină şi gentamicina, rezistenţă cunoscută ca fiind determinata de o serie de gene situate la nivelul unor elemente transpozabile sau plasmide.

Efectele benefice ale bacteriilor lactice se bazează pe sinteza de compuşi biologic activi, dintre care unii sunt esenţiali pentru acţiunea lor antimicrobiană. Analizele efectuate au evidenţiat faptul că majoritatea tulpinilor selectate prezintă activitate antimicrobiană faţă de tulpinile patogene implicate în producerea de infecţii gastrointestinale, pentru trei dintre acestea (tulpinile19.3, 41.2, 26.1) fiind corelată cu biosinteză de bacteriocine. Trebuie precizat că spectrul cel mai larg de activitate l-a prezentat bacteriocina izolată de la tulpina 19.3. În privinţa capacităţii de sinteză a altor compuşi activi deosebit de importanţi precum sunt acizii organici, cercetările au arătat că toate tulpinile de bacterii lactice prezintă concentraţii ridicate de acid lactic şi acid acetic. O singură tulpina (34.1) biosintetizează o gamă largă de acizi organici (acid butiric, acid fenillactic, acid hidroxifenilllactic, acid succinic, acid malic şi acid formic).

Un criteriu de selecţie al tulpinilor probiotice este reprezentat de evaluarea capacităţii acestora de a adera şi de a interacţiona cu celulele organismului gazdă, ceea ce permite microorganismelor de tip probiotic să colonizeze tractului digestiv şi să-şi exercite efectele benefice pentru o perioadă mai lungă de timp. Sudiile efectuate pe linia celulară HTC-8 au arătat că tulpinile izolate de la nivelul tractului digestiv au o capacitate mai ridicată de aderenţă comparativ cu cele izolate din produse fermentate. De asemenea, majoritatea tulpinilor nu au manifestat efect citotoxic şi nu au indus modificări morfologice celulelor epiteliale.

Tulpinile de bacterii lactice trebuie, în plus să reziste condiţiilor mediului gastrointestinal. Din această cauză pe lângă analiza rezistenţei la diferite valori de pH, săruri biliare şi enzime digestive, tulpinile selectate au fost testate într-un sistem unicameral de simulare gastrointestinală (GIS1). Rezulatele au dovedit că rezistenţa la condiţiile tractului digestiv, este dependentă de tulpină, dar şi de condiţiile existente la nivelul fiecărui segment al tractului digestiv.

În concluzie, obiectivele propuse în cadrul acestei etape au fost în totalitate îndeplinite, iar o parte dintre rezultatele obţinute au fost incluse în 3 articole publicate în reviste indexate ISI. Trebuie menţionat că sistemul utilizat pentru testarea rezistenţei tulpinilor de bacterii lactice la condiţiile tractului gastrointestinal, realizat de partenerul P3 –USAMVB prin Prof. Dr. Emanuel Vamanu a căpătat recunoaşterea internaţională prin câştigarea medaliei de aur la Salonul internaţional de invenţii 2013 de la Geneva.

 

Rezultate etapa III/2014

Pentru utilizarea optimă a microorganismelor probiotice este necesară înţelegerea mecanismelor prin care acestea acţionează în vederea potenţării efectelor benefice exercitate de acestea asupra organismului gazdă. Tulpinile de microorganisme din produsele probiotice trebuie să îmbunătăţească starea de sănătate a organismului gazdă, fără a modifica însă homeostazia intestinală, ceea ce impune testarea riguroasă a tulpinilor înainte de includerea lor într-un produs probiotic.

Pentru atingerea obiectivului major al acestei etape, respectiv obţinerea unor consorţii de bacterii lactice cu efect probiotic, au fost continuate o serie de activităţi începute în anul 2013 şi s-au efectuat analize preliminare pentru testele ce vor fi finalizate în 2015. În cadrul acestei etape s-au derulat următoarele activităţi: analiza interacţiunii bacteriilor lactice cu microorganismele patogene şi anumite linii celulare, efectul imunomodulator al tulpinilor de bacterii lactice/fracţiilor microbiene, analiza compuşilor biologic activi şi determinarea rezistenţei tulpinilor la tranzitul prin tractul gastrointestinal uman, influenţa condiţiilor de creştere asupra biosintezei compuşilor cu acţiune antimicrobiană, evaluarea inhibiţiei de creştere între microorganismele din consorţii, evaluarea unui potenţial sinergism în ceea ce priveşte efectele benefice ale tulpinilor de bacterii lactice de la nivelul consorţiilor, influenţa tulpinilor microbiene care vor intra în consorţiu asupra microbiotei umane simulate în sistemele GIS1 şi analiza din punct de vedere chimic a probelor prelevate din sistemele GIS1. Rezultatele obţinute au condus la realizarea unor consorţii constituite din tulpinile de bacterii lactice selectate, care vor face obiectul analizelor ulterioare în vederea stabilirii consorţiului optim din punct de vedere al efectului probiotic.
Obiectivele propuse în cadrul prezentei etape au fost complet realizate şi o parte din rezultatele obţinute în cadrul acestei etape, precum şi în etapele anterioare au fost incluse în 4 articole publicate în reviste indexate ISI, 3 articole publicate in reviste indexate în baze de date internationale şi în 6 prezentări la congrese/simpozioane internaţionale şi publicate în rezumat.
 
Rezultate etapa IV/2015

În ultimii ani studiile realizate privind obţinerea de produse de tip probiotic şi elucidarea mecanismelor implicate în îmbunătăţirea stării de sănătate a consumatorului, au evidenţiat nu numai complexitatea interacţiunilor dintre microorganismele probiotice şi organismul gazdă (inclusiv microbiota de la nivelul tractului gastrointestinal), dar şi faptul că efectele sunt tulpină specifice. Pentru obţinerea unui efect probiotic cumulat şi potenţat în cadrul prezentului proiect obiectivul major este reprezentat de realizarea de consorţii de bacterii lactice cu efect probiotic.

Obiectivele operaţionale ale etapei IV-2015 au urmărit: caracterizarea compuşilor cu acţiune antimicrobiană produşi de bacterii lactice şi influenţa condiţiilor de creştere; influenţa consorţiilor asupra microbiotei umane simulate în sistemul GIS2; analiza din punct de vedere chimic a probelor prelevate din sistemele GIS2; analiza cantitativă a influenţei consorţiilor de bacterii lactice asupra profilului compuşilor secretaţi de celulele epiteliale şi evaluarea citotoxicitatii consorțiilor şi identificarea taxonomică a tulpinilor de bacterii lactice prin tehnici de biologie moleculară. 

Toate obiectivele propuse în cadrul prezentei etape au fost îndeplinite şi din cele 10 consorţii realizate în cadrul etapei anterioare, pe baza studiilor desfăşurate au fost selectate şi analizate 3 care au prezentat activitate antimicrobiană şi/sau activitate imunomodulatrie potenţată.

O parte din rezultate au fost diseminate prin publicare în 4 articole ISI (1 articol publicat şi 3 acceptate), 2 articole BDI, un brevet şi 4 participãri la manifestãri ştiinţifice internationale.

Este de menţionat faptul că sistemul GIS2 a fost premiat cu medalia de aur la salonul EuroInvent 2015.

 
 
Rezultate etapa V/2016

Principalul obiectiv al acestei etape a constat în evaluarea funcţionalităţii consorţiului bazat pe tulpini de bacterii lactice (BL). Pentru atingerea acestui obiectiv au fost parcurse o serie de etape care au vizat: analiza influenţei consorţiului asupra microbiotei umane simulate în sistemele GIS2; analiza din punct de vedere chimic a probelor prelevate din sistemele GIS2; analiza calitativă şi cantitativă a influenţei consorţiului  de BL asupra capacităţii de aderenţă a microorganismelor patogene la tumori prelevate de la nivelul tractului gastrointestinal; identificarea taxonomică a BL din consorţiu prin tehnici de biologie moleculară; evaluarea parametrilor biologici şi stabilităţii caracteristicilor probiotice în diferite condiţii de conservare şi stocare; îmbunătăţirea modelului experimental pentru obţinerea de produse probiotice complexe şi pentru anticiparea activităţii probiotice in vivo.

Obiectivele propuse în cadrul acestei etape au fost atinse şi s-au finalizat cu obtinerea unui consorţiu de BL cu efect probiotic. Consorţiul de BL, alcătuit din tulpinile: Lactobacillus (L.) casei, L. fermentum şi L. plantarum, a fost retestat privind capacitatea probiotică în vederea stabilirii condiţiilor optime de conservare.

Rezultate au fost diseminate prin publicare în 4 articole ISI (2 articole publicate şi 2 acceptate), un articol BDI, 2 participări la manifestãri ştiinţifice internaţionale si 2 brevete nationale.